巴萨4比4比利亚雷亚尔 www.0ugx.com 重组蛋白简单的说就是是人工合成蛋白。在知道编码该蛋白的基因序列之后,人工克隆该基因进入质粒。然后再把质粒转染如大肠杆菌。这样大肠杆菌就成了蛋白表达的工厂。表达出来的蛋白再进过分离纯化,就是重组蛋白。目前重组蛋白在制药工业上主要是指表达获得的细胞因子、凝血因子或者人工设计的蛋白分子。

研究重组蛋白的作用时要先做体外实验,再做体内实验。知道大致是哪方面的功能,否则就是瞎撞了??梢源又刈榍暗牡鞍椎墓δ苤醒罢曳较?,如果什么都不知道就在细胞中加点重组蛋白,先做个MTT看看细胞死活,确定有没有功能。


以大肠杆菌为例介绍一下重组蛋白质的提取步骤。

(1) 大肠杆菌的酶解:

1) 4℃ 、1000g离心15 min收集细菌细胞,倒去上清液,将湿细菌称重。

2) 每克细菌细胞中加入约3 ml溶菌酶缓冲液(50mmol/L Tris·HCl,pH 8. 0;lmmol/L EDTA;50mmo1/L NaCl; lmmol/L PMSF),涡旋,使菌体完全悬浮,加入溶菌酶,终浓度至0. 3mg/ml,于4℃搅拌30min。

3)搅拌下加入脱氧胆酸盐,终浓度至1 mg/ml。

4)加入核酸酶,终浓度至10mg/ml,搅拌下室温作用15 min。

5) 4℃、10000g离心15 min,分别收集上清液和沉淀,进行SDS-PAGE,确定目标蛋白质存在于哪个组分中,如果目标蛋白质位于沉淀中,则重组蛋白是以包涵体的形式存在。

(2)包涵体的清洗:

1) 将破菌后的沉淀重悬于适当的缓冲液中,涡旋混合5 min,离心收集沉淀。

2)将上述沉淀重悬于1%的Triton X-100中,涡旋混合5 min,离心收集沉淀。

3) 将上述沉淀重悬于4mol/L的尿素或盐酸肌中,涡旋混合5 min,离心收集沉淀。

4)将破菌后的沉淀重悬于适当的缓冲液中,涡旋混合5 min,离心收集沉淀。

根据清洗的情况,可以适当地增加2)、3)步的洗涤次数。

(3) 从包涵体中溶解重组蛋白:在溶解包涵体时,可以选用2%的SDS、8mol/L的尿素或8mol/L的盐酸肌等裂解液,根据蛋白质的特性、实验的要求进行选择,并进行优化。下面以8 mol/L盐酸肌为例,溶解包涵体中的重组蛋白质。

1)用裂解液(50mmo1/L Tris·HCl, pH 8.0, 8mo1/L盐酸胍,1mmol/L DTT)重悬清洗后的包涵体,如果重悬困难,可适当地进行超声处理,然后在室温下作用lh,并不时地涡旋混合。

2) 4℃、20000g离心30min,除去不溶性物质,保留上清。

提取方法:

一.固液萃取
在固液萃取中,提取物是由固相转为液相,或由细胞内转为细胞外,其提取效率与物质的扩散作用有关。
为了增加扩散物质的量,也就是提高提取速度,常采用如下措施:
1)提高材料的破碎程度,以增加扩散面积,减少扩散距离;
2)进行搅拌,使已扩散的溶质迅速与溶剂混匀,以保持两项界面最大浓度差,或分多次提取,不断更换新鲜溶剂,以提高扩散速率;
3)延长提取时间,提高提取温度,以及减少溶液粘度(如属大分子核酸干扰,加入少量鱼精蛋白或硫酸链霉素沉淀除去)等。
实际上从破碎后的固体细胞提取所需组分,当细胞破碎程度及提取温度受到限制时,采用少量多次提取方法较为有利。
二.液液萃取
液液萃取选用的溶剂必须与被抽提的溶液互不混合、且对被抽提的溶质有选择性的溶解能力。最常用的液液萃取溶剂为二相溶剂,水或水-醇为一相,与水互不相溶的各种碳氢化合物,如低级醚、酯、苯酚等,为另外一相。  


提取一些具有生理活性的物质时,除了考虑被提取物溶解度外,还应考虑被提取物活性的?;?。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说,主要措施有如下几点;
1.采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离,造成溶液中PH值变化幅度过大,导致某些活性物质的变性、或由于PH变化影响提取的效果。在生化制备中,提取中常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等。
[缓冲液] 分为非-双性离子缓冲化合物类和双性离子缓冲化合物类。前者包括HCl-KCl、甘氨酸-HCl、乌头酸盐-NaOH、柠檬酸盐-磷酸盐、柠檬酸盐-NAOH、醋酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯二酸盐-NAOH、磷酸盐、TRIS-HCL、硼酸-硼砂、甘氨酸-NAOH、碳酸盐-碳酸氢盐等,存在反应性和缓冲能力有限等缺点。双性离子缓冲液虽然具有很多优点,但依然存在反应性与不适应性的问题,如HEPEs是氨基丁酸的拮抗性(反应性)、不适应于所有的组织培养(不适应性)。
2.加入?;ぜ?防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的巯基,是许多活性物质和酶催化的活性基团,极易被氧化,故提取时常加入一些还原剂。一些易受重金属离子抑制生理活性的物质,加入某些金属螯合剂,把有害金属离子螯和掉,而保持被提取物的活性。 [螯合剂和巯基试剂] 巯基试剂在生化反应中有两个用途,一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S,二是某些酶反应中维持体系的还原环境。经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物(如二硫苏糖醇DTT、二硫赤酰糖醇DTE)和2-巯基乙醇,谷胱甘肽也经常应用。一般来说二硫丁醇类是常选用的巯基试剂,不仅是因为挥发性低,难闻的气味较少,而且氧化电位低,比2-巯基乙醇浓度低很多的情况下,可以使其他二硫化合物完全还原。螯合剂用于控制反应中金属离子浓度或去除金属离子,常用的螯合剂有EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA、1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸等。
3.抑制水解酶的破坏 根据不同水解酶的性质采用不同方法。如需要金属离子激活的水解酶,常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液除去溶液中的某些金属离子,使酶的活性受到抑制;对热不稳定的水解酶,可以用热提取法使之失去作用;或选用PH范围,使酶活性最低;还可针对性地加入某些抑制剂,以抑制水解酶的活性,但此类方法在蛋白提取中应用较少。
4.其它一些特殊要求的?;ご胧?除避免紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等情况外,有些蛋白质在提取时还有特殊要求,如固氮酶钼-铁蛋白,必须在无氧条件下进行。  

重组蛋白的分离纯化有:1、沉淀分离技术(盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、变性沉淀法) 2、液液萃取技术 3、层析法(离子交换层析、疏水层析、反相层析、亲和层析)

重组蛋白分离纯化技术近几年发展迅速,今后重组蛋白的分离纯化技术的发展将围绕着快速、高分辨率。高上样量、易于操作、低成本和电脑控制的全自动化等技术面展开。希望今后能有更多更好的方法来提纯蛋白吧~