巴萨4比4比利亚雷亚尔 www.0ugx.com 蛋白互作几种方法比较? ? IP与CO-IP的关系:? IP就是用抗体把你要的蛋白免疫沉淀下来,然后去检测它。例如蛋白A在细胞内的蛋白量不同,或者有着不同的翻译后修饰,这是可以用A蛋白的抗体+prorein?A?beads来IP,从细胞中把A拉下,再用特异的抗体(如磷酸化,泛素化抗体)来检测A的变化。?? co-ip的原理和IP是一样的,但是它检测的是和A相互作用的蛋白,也就是说用A的抗体把A拉下来后,用和A相互作用蛋白B的抗体去检测,来证明A和B之间的相互作用。?就是说只要用A的抗体把B拉下来就能证明A和B之间有相互作用。?? 这种关系只能说是存在相互作用,但这种相互作用并不能确定是直接的还是间接的,也就是所也许是A与c作用,而B也和C作用,这样,用A的抗体可以把C拉下来,但同时C又把B也拉下来了。要确定A和B之间直接的相互作用,你可以做体外的GST?PULL?DOWN实验。?? GST?pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。(GST:谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione?S-transferase))

GST?pull?down?和?Coimmunoprecipitation关系问题? 啥叫GST?pull?down?,?Coimmunoprecipitation呢??学过生物的地球人都知道.?这是研究蛋白质相互作用的两种方法。?? 简单通俗的打个比方,?GST?pull?down?就像把一男一女放在孤岛上,?除非蜂马牛不相及,?同类男女之间该发生的一般都会发生.?这种关系是直接的。? ? Coimmunoprecipitation,?(Co-IP)?则是,?众里寻他千百度,?那人却在灯火阑珊处.?研究一群男女间的自由恋爱问题.?一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白,?但是最终还是会有个最喜欢的,?而在Co-ip中就能发现他的喜好.?这种关系可能是直接的,?也可能是间接的,?是更接近于东方的。?? 两个蛋白可能在生物体内素昧平生,?一个在头上,?一个在脚上.?也许两者之间或许很合辙,?生来却天各一方.?在GST?pull?down?的环境中,?他们可能相遇,?吸引在一起.?但在现实生活中,?这样的浪漫关系可能是不现实的.?脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会,?人就要出大问题.?还有的情况是,?两个蛋白即使独处在一起,?也可能不会互相吸引,?但是到了生物系统的大环境中,?在其他蛋白,?各种因素适当的辅助下,?却有可能形成稳定的搭档关系。

免疫共沉淀实验由于在非变性实验条件性进行,这样蛋白质之间的天然相互作用得以很大程度的保留,因此可以比较真实的反应蛋白质之间的相互作用。但也基于此点,免疫共沉淀并不能显示蛋白质之间的相互作用是直接还是间接的,因为通过目的蛋白抗体共沉淀下来的是一个蛋白复合物,而不仅仅是和目的蛋白直接相互作用的蛋白。而GST-Pull?down实验可以通过体外实验条件,去除其它蛋白的影响,从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。?? 做蛋白质相互作用的三个经典方法,也可以说是逐步严谨的方法。?? 凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)? 凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA,?electrophoretic?mobility?shift?assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。?通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测?如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),?和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

GST亲和层析和GST?Pull-down方法?? 此方法的基本原理是:利用重组技术将探针蛋白与GST(Glutathione?S?transferase)融合,融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH(Glutathione)亲和结合。因此,当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。在病毒受体研究中,融合蛋白通常设计为病毒吸附蛋白(VAP)。这方面成功的例子有HBV。具体做法如下:将GST-融合探针蛋白?(VAP)和GTH-Sepharose制成亲和层析柱,然后待分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱,梯度洗脱,?分离、收集各蛋白组分,这称为GST亲和柱层析(GST?affinity?column?chromatography)。?? 如果一开始待检蛋白就和GST-?融合探针蛋白与?GTH-Sepharose一起共同孵育,经离心收集洗脱复合物和洗涤后,再加入过量GTH获得相互作用蛋白的复合物,那么这种方法则称为GST?pull?down。? GST亲和层析及相应的GST?Pull-down方法的优点是敏感,对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”,也可用于受体功能的鉴定。缺点是GST有可能影响融合蛋白的空间结构,另外,蛋白质浓度对实验也有一定影响。